——依托国产高端临床前超高场科研磁共振uMR 9.4T,科学家开发出基于特异性蛋白质的MRI造影剂,可实现小鼠全身结构和脑血管系统的高分辨率、长时间窗成像,为未来临床诊断提供了新的成像工具。

  新加坡国立大学刘小钢院士、中国科学院深圳先进技术研究院郑海荣院士和盛宗海研究员,在合成基于特异性蛋白质的高效磁共振造影剂中取得重要进展。近日,该研究成果以“Single-point mutated lanmodulin as a high performance MRI contrast agent for vascular and kidney imaging”为题发表于国际知名综合类科学杂志《Nature Communications》(IF:14.7)。

  研究团队通过在稀土结合蛋白(Lanmodulin)中引入单点突变,制备了能够高效地与Gd3+离子结合LanND-Gd蛋白复合物,依托磁共振系统的超高场强、超高分辨率、无创性、无辐射和多参数成像等优势,结合新型蛋白复合物MRI造影剂的高分辨率、长时间窗和低毒性等优点,成功实现了小鼠全身结构和脑血管系统的高分辨率成像,为超高场临床前磁共振的进一步应用提供了新的特异性造影剂。

  研究背景 BACKGROUND

  磁共振成像(MRI)作为一种临床成像的重要手段,能够实现无辐射风险的高清晰度成像。目前常用的基于顺磁性钆(Gd3+)的MRI造影剂存在有效成像时间短、组织特异性低、对比增强效果差以及具有潜在毒性等问题,导致在微米尺度上显示复杂生物结构(如复杂的脑部小血管系统)的分辨率不足,限制了其在相关疾病诊断中的应用。同时,此类造影剂在体内保留时间短,严重影响对脑部疾病或肾脏疾病的实时监测。因此,亟需开发出分辨率更高、时间窗更长、毒性更低的MRI造影剂。

  研究团队设计了一种衍生于Lanmodulin(LanM)的MRI造影剂,通过在LanM中引入单点突变,构建了能够与Gd3+结合更加高效的基于蛋白质的造影剂,并在小鼠中对血管成像分辨率、肾功能障碍监测效果以及毒性功能进行探索和验证。

  研究方法 METHODS

  研究团队基于转基因技术,构建了一种新型磁共振造影剂LanND-Gd,其对Gd3+的亲和力和结合紧密度均优于商用造影剂LanM。研究人员使用超高场临床前科研磁共振系统——联影生命科学仪器uMR 9.4T验证其特性,并通过免疫组织化学、行为学等实验验证其生物安全性。

  研究团队使用的序列参数如下:TR= 10.39 ms; TE= 1.75 ms; FOV= 18 × 22 mm2; NEX= 1; FA= 20°; voxel size= 0.1 × 0.1 × 0.1 mm3; matrix size= 224 × 183; slice thickness= 0.1 mm; number of slices= 160; bandwidth/pixel= 195 Hz/pixel; over-sampling= 10 %; echo train length= 1。

  研究结果 RESULTS

  1. 基于LanM构建LanND的设计过程和特点

  LanM包含一个信号肽和四个具有丰富带负电荷的残基区域,可实现与Gd3+阳离子结合。研究团队引入了N108D单点突变,构建了突变体LanND,通过将与Gd3+的结合位点数量从1增加到4,显著增强了与Gd3+的结合能力。

  研究团队以二甲酚橙作为指示剂进行滴定实验。结果表明,与LanM结合Gd3+的化学计量2.2相比,LanND的化学计量提升至3.8。染料竞争试验进一步证明了LanND与Gd3+的结合亲和力优势。

  图1 LanND的制备

1.   LanND-Gd复合物的MRI效果

  研究团队将Gd3+与LanND结合,得到基于特异性蛋白质的造影剂LanND-Gd。在7 T的磁场强度下,与临床常用的Magnevist造影剂相比,LanND-Gd造影剂弛豫性增强,有效分子弛豫率超过Magnevist造影剂的10倍以上。

  图2 LanND-Gd复合物的MRI效果

  3. LanND-Gd在脑血管中的高分辨率成像

  LanND的结构尺寸约为3.3 × 3.7 × 3.0 nm3。流体动力学测量表明,未结合离子的LanND和Gd3+结合蛋白质尺寸都小于5 nm,能够从体内彻底排泄,降低了造影剂体内滞留的风险,提高了造影剂的安全性和转化潜力。

  研究人员先确认了LanND-Gd中Gd3+与蛋白质主干的结合是否稳定以及是否会引起毒性作用。研究团队使用Gd3+敏感的机械门控离子通道Piezo1探测Gd3+的异常泄漏。单通道记录结果显示,LanND-Gd并不影响该Piezo1通道的开放频率。此外,模拟体内条件进行竞争滴定结果显示,LanND-Gd的结合牢固可靠,并在复杂环境中依旧能够维持其正常的显影功能,为体内的安全应用提供了基础。

  确认LanND-Gd的结合稳定性后,研究人员按照临床常用的Magnevist造影剂给药方案,向小鼠静脉注射LanND-Gd,随后使用临床3 T MRI系统获取了注射后10 min小鼠全身的T1加权3D梯度回波图像。图像显示,LanND-Gd组中小鼠的各种器官(血管、心脏、大脑和肾脏)信号强度显著增强,尤其在脑血管中对比度更强。

  研究团队依托超高场磁共振uMR 9.4T,探索新型造影剂在脑血管系统中可实现的最高分辨率。结果显示,静脉注射LanND-Gd后,直径约为100 μm的复杂血管结构变得清晰可见,与Magnevist造影剂相比,LanND-Gd在信噪比和空间分辨率方面均表现更佳。

  在神经系统半衰期方面,持续监测显示残留的Magnevist造影剂会在眼睛中长时间存在,LanND-Gd则更易从大脑中彻底清除,表明该造影剂在神经系统中具有一定的安全性保证。

  为了进一步确认LanND-Gd在血液中的药代动力学和稳定性,研究团队收集了注射LanND-Gd或Magnevist造影剂后不同时间点的血清。结果显示,LanND-Gd的代谢曲线与Magnevist造影剂的相似,且在骨中的含量较低,表明该造影剂具有一定的结合稳定性。

  图3 LanND-Gd在脑血管中的高分辨率成像

  4. LanND-Gd的肾脏代谢效率

  传统商用造影剂在血液循环和尿液代谢中常容易被细胞内吞,进而在器官中积累,可能具有潜在毒性。研究人员在小鼠全身磁共振成像的肾脏和膀胱中观察到明显的MRI信号,表明肾脏可以有效过滤LanND-Gd,并通过尿路排泄。

  为了观察LanND-Gd的生物分布情况,研究人员将荧光蛋白GFP作为标签与LanND-Gd进行遗传融合,并使用IVIS光谱活体成像系统观测荧光信号。结果显示,该信号在膀胱中积累后减弱,证明了LanND-Gd通过尿路排泄。此外,肾脏中的荧光信号在注射后60分钟内仍保持相对稳定,表明其具有肾功能长期监测的潜力。

  图4 LanND-Gd的肾脏代谢效率

  5. 基于LanND-Gd的肾功能长期监测

  由于LanND-Gd的分子量比Magnevist大很多,结合尿液代谢观察到其在肾脏中停留时间较长,研究团队使用对单侧肾缺血再灌注损伤小鼠模型给药LanND-Gd,用于验证LanND-Gd在长期监测肾功能中的应用可能性。

  结果显示,Magnevist仅能在肾脏中停留10分钟,而LanND-Gd造影剂能够引起两肾磁共振信号差异至少保持2小时,证明了其在肾功能长期监测中的潜在应用价值。

  图5 LanND-Gd的在长期监测肾脏功能中的应用

  6. 生物相容性、神经毒性和潜在免疫反应

  研究团队最后研究了LanND-Gd的生物相容性、神经毒性和潜在免疫反应。免疫组化实验、LanND-Gd与皮层神经元共培养以及小鼠基本体征和进食、运动等实验结果均表明,LanND-Gd生物相容性好、无神经毒性、无潜在免疫反应。

  图6 LanND-Gd的生物安全性验证

  研究展望 PROSPECT

  研究团队开发了一种基于特异性蛋白质的磁共振造影剂LanND-Gd,相比商用造影剂,极大提升了成像分辨率、时间窗和安全性性能。使用超高场临床前科研磁共振系统——联影生命科学仪器uMR 9.4T对该造影剂进行活体影像学评估,成像结果可以清晰显示小鼠脑部细微血管,展现了新开发的造影剂在肾功能长期监测中巨大的潜在应用价值,以及高精度磁共振在临床诊断和慢性病长期监测中的应用前景。

  研究团队在磁共振成像这一关键创新点上使用了基于联影生命科学仪器uMR 9.4T,实现在非侵入性、高分辨率和低背景干扰的条件下,清晰表征了基于特异性蛋白质的磁共振造影剂的优势,为该造影剂的进一步临床应用打下了坚实的实验室基础。

  ————参考文献————

  [1]Liu Y, Gao D, He Y, Ma J, Chong SY, Qi X, Ting HJ, Luo Z, Yi Z, Tang J, Chang C, Wang J, Sheng Z, Zheng H, Liu X. Single-point mutated lanmodulin as a high-performance MRI contrast agent for vascular and kidney imaging. Nat Commun. 2024 Nov 13;15(1):9834.